Amplificamos una secuencia de ADN de 800pb del promotor de UGA-3. Para esto usamos la técnica de PCR, los componentes para llevar a cabo esta son:
Buffer
dntp
MgCl2
Primer
DNA pol (Taq polimerasa, termoestable, sobrevive a las altas temperaturas)
Molde de DNA genómico
H2O
Calculamos sus concentraciones necesarias para que todo este en 150 μl
*A la hora de mezclar todo es importante tener en cuenta que lo primero que se debe poner es el agua y el Buffer porque los demás componentes son muy sensibles como para colocarlos en el tubo vació sin que nada les pase.
Preparamos tres tubos de PCR con 50 μl cada uno de mezcla. Dos de ellos con el molde (los llamaremos positivos (+)) y uno sin él (a este lo llamaremos negativo (-)). Es necesario hacer el tubo negativo porque nos indica si hubo contaminación o no y si lo que tengo en los tubos es sólo el ADN gel gen UGA-3 o también otras cosas. Nos queremos asegurar de estar amplificando sólo la secuencia seleccionada.
Para hacer la PCR se hace un programa dónde se calienta todo a 94°C (para separar las cadenas de ADN) se baja la temperatura a 63°C (a esta temperatura se unen los primers) y luego se sube a 72°C (que es la temperatura óptima para la polimerización). Este programa se hace en ciclos para amplificarlo y tener mucho producto.
Buffer
dntp
MgCl2
Primer
DNA pol (Taq polimerasa, termoestable, sobrevive a las altas temperaturas)
Molde de DNA genómico
H2O
Calculamos sus concentraciones necesarias para que todo este en 150 μl
*A la hora de mezclar todo es importante tener en cuenta que lo primero que se debe poner es el agua y el Buffer porque los demás componentes son muy sensibles como para colocarlos en el tubo vació sin que nada les pase.
Preparamos tres tubos de PCR con 50 μl cada uno de mezcla. Dos de ellos con el molde (los llamaremos positivos (+)) y uno sin él (a este lo llamaremos negativo (-)). Es necesario hacer el tubo negativo porque nos indica si hubo contaminación o no y si lo que tengo en los tubos es sólo el ADN gel gen UGA-3 o también otras cosas. Nos queremos asegurar de estar amplificando sólo la secuencia seleccionada.
Para hacer la PCR se hace un programa dónde se calienta todo a 94°C (para separar las cadenas de ADN) se baja la temperatura a 63°C (a esta temperatura se unen los primers) y luego se sube a 72°C (que es la temperatura óptima para la polimerización). Este programa se hace en ciclos para amplificarlo y tener mucho producto.
Programa utilizado:
94°C 5min
94°C 1min\
63°C 1min ) se repite 30 veces.
72°C 2min/
72°C 5min
94°C 5min
94°C 1min\
63°C 1min ) se repite 30 veces.
72°C 2min/
72°C 5min
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