Extrajimos los plásmidos de las bacterias E. Coli de nuestro medio LB, siguiendo detalladamente los pasos del protocolo adecuado:
Tomamos una alícuota de 5 ml de nuestro cultivo de bacterias E.Coli y lo centrifugamos, quedándonos con el pellet (el sobrenadante esta compuesto por los componentes del medio y en el pellet estan las bacterias)
Agregamos un Buffer que tiene EDTA (por su acción quelante ayuda a desestabilizar más adelante a la membrana bacteriana) también tiene un colorante azul, Lyse Blue, (que me indica cuando todo esta homogeneizado).
Agregamos otra solución Buffer (compuesta por NaOH y SDS). Se produce una lisis básica, y el colorante de transparente cambia a azul. Hay que mezclar por inmersión, ya que todo lo que tengo dentro del tubo es demasiado sensible, hasta que el color azul sea igual en todos lados.
Agregamos el tercer Buffer que baja el pH favoreciendo la renaturalización del ADN. pero como es un cambio brusco se renaturaliza mal y lo que obtengo es todo un precipitado de restos de membranas,paredes ADN genómico etc., el colorante pasa de azul a incoloro (se mezcla por inmersión nuevamente).
Como el plásmido es muy chiquito y además esta unido fisicamente, no se separa y se puede renaturalizar bien. Me queda en solución.
centrifugamos.
Colocamos la solución en una columnita donde va a quedar unido en la recina el ADN, pasando a través de ella (enzimas, etc). Centrifugar.
Lavamos con un Buffer que separa proteínas y sales del plásmido. Centrifugar.
Se le agrega otro Buffer con el fin de seguir lavando y purificando nuestro plásmido. Centrifugamos. Colocamos otro Buffer que va a despegar el plásmido de la columnita (centrifugando para asegurarnos que bajo todo el plásmido purificado).
Preparamos un Gel de agarosa 1% p/v en 45 ml
Colocamos en los pocillos del gel las tres PCR y la solución del plásmido (cada una con 1,25 μl de Buffer loading (que por su densidad, contiene glicerina, nos ayuda a sembrar haciendo lo que sembramos baje al posillo y no se quede flotando, y el colorante que tiene nos permite visualizar el frente de corrido).
La semana que viene vamos a ver los resultados de otro gel de agarosa.
Tomamos una alícuota de 5 ml de nuestro cultivo de bacterias E.Coli y lo centrifugamos, quedándonos con el pellet (el sobrenadante esta compuesto por los componentes del medio y en el pellet estan las bacterias)
Agregamos un Buffer que tiene EDTA (por su acción quelante ayuda a desestabilizar más adelante a la membrana bacteriana) también tiene un colorante azul, Lyse Blue, (que me indica cuando todo esta homogeneizado).
Agregamos otra solución Buffer (compuesta por NaOH y SDS). Se produce una lisis básica, y el colorante de transparente cambia a azul. Hay que mezclar por inmersión, ya que todo lo que tengo dentro del tubo es demasiado sensible, hasta que el color azul sea igual en todos lados.
Agregamos el tercer Buffer que baja el pH favoreciendo la renaturalización del ADN. pero como es un cambio brusco se renaturaliza mal y lo que obtengo es todo un precipitado de restos de membranas,paredes ADN genómico etc., el colorante pasa de azul a incoloro (se mezcla por inmersión nuevamente).
Como el plásmido es muy chiquito y además esta unido fisicamente, no se separa y se puede renaturalizar bien. Me queda en solución.
centrifugamos.
Colocamos la solución en una columnita donde va a quedar unido en la recina el ADN, pasando a través de ella (enzimas, etc). Centrifugar.
Lavamos con un Buffer que separa proteínas y sales del plásmido. Centrifugar.
Se le agrega otro Buffer con el fin de seguir lavando y purificando nuestro plásmido. Centrifugamos. Colocamos otro Buffer que va a despegar el plásmido de la columnita (centrifugando para asegurarnos que bajo todo el plásmido purificado).
Preparamos un Gel de agarosa 1% p/v en 45 ml
Colocamos en los pocillos del gel las tres PCR y la solución del plásmido (cada una con 1,25 μl de Buffer loading (que por su densidad, contiene glicerina, nos ayuda a sembrar haciendo lo que sembramos baje al posillo y no se quede flotando, y el colorante que tiene nos permite visualizar el frente de corrido).
La semana que viene vamos a ver los resultados de otro gel de agarosa.
No hay comentarios:
Publicar un comentario