Ensayo de genes reporteros, según el método de Miller, comprobamos la actividad de la b-galactosidasa.
Se le agrega un sustrato a las muestras que contienen otros compuestos, para saber si estas interfieren en la actividad de la enzima, el producto que da esta al reaccionar con ONPG es amarillo y se mide en espectrofotómetro.
Tomamos una alícuota de los tubos de la semana pasada y les agregamos Buffer Z. Colocamos SDS y cloroformo para que luego al poner ONPG, esta sustancia pueda entrar, al agregar esto, la b-galactosidasa comienza a catalizar la reacción y cuando haya producto (este amarillo) se la frena con Na2CO3 y se lo coloca en frió. (hacemos las muestras por duplicado y cada 30 segundos agregamos ONPG a los tubos).
Anotamos el tiempo inicial y el tiempo final de la reacción. Sacamos la densidad celular de los ml sobrantes de los tubos a una Absorbancia a 570 nm. La Absorbancia para las unidades Miller es a 420 nm. Hacemos una tabla que incluya todos los valores y además un gráfico donde figure las unidades Miller en función del tiempo.
Se le agrega un sustrato a las muestras que contienen otros compuestos, para saber si estas interfieren en la actividad de la enzima, el producto que da esta al reaccionar con ONPG es amarillo y se mide en espectrofotómetro.
Tomamos una alícuota de los tubos de la semana pasada y les agregamos Buffer Z. Colocamos SDS y cloroformo para que luego al poner ONPG, esta sustancia pueda entrar, al agregar esto, la b-galactosidasa comienza a catalizar la reacción y cuando haya producto (este amarillo) se la frena con Na2CO3 y se lo coloca en frió. (hacemos las muestras por duplicado y cada 30 segundos agregamos ONPG a los tubos).
Anotamos el tiempo inicial y el tiempo final de la reacción. Sacamos la densidad celular de los ml sobrantes de los tubos a una Absorbancia a 570 nm. La Absorbancia para las unidades Miller es a 420 nm. Hacemos una tabla que incluya todos los valores y además un gráfico donde figure las unidades Miller en función del tiempo.
Si bien creíamos que habíamos trabajado bien y las Absorbancia dieron dentro del todo acertadas a la hora de hacer el grafico obtuvimos unos resultados muy malos y unas rectas ilógicas.
El gráfico si nos hubiera dado bien tendria que haber sido algo asi
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