Decimoprimer semana (24/07/08)

Comenzamos con la introducción del trabajo.
Le preguntamos nuestras dudas a Sabrina, ella nos dio papers, nos explico otros temas y nos dio más información.

Décima semana (17/07/08)

Preparamos tres medios de Crecimiento:

Medio LB (para crecer bacterias):
·Extracto de levadura 0,5%
·NaCl 1%
·Peptona 1%
·Agar 2%

Medio YPD (medio rico, para crecer levaduras)
·Y (extracto de levadura) 1%
·P (peptona) 2%
·D (dextrosa/glucosa) 2%
·Agar 2%

Medio YNB-DO (medio mínimo URA(-) para crecer levaduras)
·YNB (yeast nitrogen base) 0,67%
·Glucosa 2%
·Drop out URA(-) 0,19 %
·Agar 2,5%

A todos los medios les agregamos agar porque vamos a hacer placas.
Autoclavamos los medios junto con tips y erlenmeyers para esterilizarlos.
Preparamos 15 placas con los medios, 5 placas para cada uno y las rotulamos.
Preparamos un buffer que hacía falta en el laboratorio, buffer Z usado, entre otras cosas, para el ensayo de B-gal de hace dos semanas.
Pesamos sus componentes al igual que hicimos con los medios, pero sin autoclavar.
Susana nos explicó como se construyen los primers y nos dio un problema para hacer.

Novena semana (10/07/08)

Comprobamos en qué nos habíamos equivocado la vez pasada, y tras pasar todo de nuevo al Excel pudimos darnos cuenta que el error que había era de unos paréntesis en las ecuaciones para sacar las unidades miller.

Con los datos corregidos, hicimos el gráfico en un programa especial y observamos que éste en realidad daba correctamente al igual que la experiencia.

Sabrina nos dio un protocolo del método Chip (chromatin immunoprecitation) en inglés, para familiarizarnos con el vocabulario y poder deducir y entender qué era cada paso y para qué era requerido.
Ésta técnica consiste básicamente en:
· fijar o dejar todo estático (uniendo covalentemente si es que hay, la unión con la proteína) utilizando formaldehido
· luego sonicar para partir el ADN en fragmentos más chicos
· se agrega una proteína que ayuda a limpiar las proteínas que están de más
· se le pone un anticuerpo que se pega a la proteína que me interesa
· luego se agrega una bola de proteína que también se pega al anticuerpo y todo esto precipita
· se hace PCR y se analiza el contenido.

Octava semana (03/07/08)

Ensayo de genes reporteros, según el método de Miller, comprobamos la actividad de la b-galactosidasa.
Se le agrega un sustrato a las muestras que contienen otros compuestos, para saber si estas interfieren en la actividad de la enzima, el producto que da esta al reaccionar con ONPG es amarillo y se mide en espectrofotómetro.
Tomamos una alícuota de los tubos de la semana pasada y les agregamos Buffer Z. Colocamos SDS y cloroformo para que luego al poner ONPG, esta sustancia pueda entrar, al agregar esto, la b-galactosidasa comienza a catalizar la reacción y cuando haya producto (este amarillo) se la frena con Na2CO3 y se lo coloca en frió. (hacemos las muestras por duplicado y cada 30 segundos agregamos ONPG a los tubos).
Anotamos el tiempo inicial y el tiempo final de la reacción. Sacamos la densidad celular de los ml sobrantes de los tubos a una Absorbancia a 570 nm. La Absorbancia para las unidades Miller es a 420 nm. Hacemos una tabla que incluya todos los valores y además un gráfico donde figure las unidades Miller en función del tiempo.

Si bien creíamos que habíamos trabajado bien y las Absorbancia dieron dentro del todo acertadas a la hora de hacer el grafico obtuvimos unos resultados muy malos y unas rectas ilógicas.

El gráfico si nos hubiera dado bien tendria que haber sido algo asi