Séptima semana (26/06/08)

Hicimos una inducción.
Día 1: se toma una colonia de levadura que contienen un plásmido ( YEP-357) y se pone en un medio mínimo, se lo deja toda la noche.
Día 2: se hace una dilución del medio y se lo deja toda la noche.
Día 3: el medio se divide en tres tubos que se centrifugan quedándonos con el pellet y agregándole de nuevo el medio mínimo pero fresco (a uno de los tres tubos se le agrega Leucina (un aminoácido)). Después de 30 minutos al tubo de los aminoácidos y a otro se le agrega GABA.
Se toma una muestra a tiempo 0 de los tres tubos y otras a los 120 minutos.
El objetivo es saber en que condiciones el gen se induce mejor, si afecta la presencia de aminoácidos en la inducción y como se ven estos cambios según la variación del tiempo.

Sabrina también nos explicó como hacer para saber si una proteína interactúa con el gen UGA 4. para eso se usa formaldehido que une covalentemente a la proteína con el gen. Después un anticuerpo y una bola de agarosa se unen con la proteína. Ésto se hace precipitar con ayuda de la centrífuga.
Luego de esto puede haber 2 posibilidades: que la proteína se pegue a UGA 4 y precipite con este, o que se pegue a otra cosa y quede el gen UGA 4 en el sobrenadante.
Si queda UGA 4 en el sobrenadante significa que la proteína no interactúa con este.
Se verifica con PCR

Sexta semana (19/06/2008)

Con un gel de agarosa corrimos las 4 colonias que mutaron de manera tal de corroborar la mutación de las colonias sembradas anteriormente. Y dió que 3 colonias dieron mutadas y una dió mezcla de células. Ésto fué realizado mediante el uso de 2 primers que permiten saber cuales mutaron, mediante el gel.
Luego Sabrina nos explicó lo que ibamos a hacer la próxima semana.

Quinta semana (12/06/08)

Chequeamos unas mutaciones de células haciendo una PCR y corriéndolas en un gel de agarosa, obtuvimos producto positivo con los primers usados para la mutada en algunas colonias y en otras mezcla de células, por esto se siembran en unas placas de petri para obtener mas colonias y poder corroborar su mutación. La mutación se hace por recombinación homóloga con un fragmento de ADN que contiene un marcador de selección URA3. Luego con primers especificos para las células wild type y para las células mutantes puedo ver si hay mutación.

Esterilizamos Ampicilina mediante la técnica de filtrado, en un flujo laminar y colocándola en 20 tubitos para poder guardarla y que no se deteriore al estarla descongelando y congelando todo el tiempo. La ampicilina viene en concentración 1000x (0,1 gr/ml).

Preparamos un medio de crecimiento, con:
Extractos de levadura 1%
Peptona 2%
Glucosa 2%
Agar 2% (para preparar placas).

La imagen es de las PCR y el plásmido de la semana pasada.
en el primer pocillo esta el marker y pocillo de por medio esta las PCR primero las positivas y luego la negativa (como no hay nada podemos afirmar que no hubo contaminación), y la ultima es la del plásmido.
la persona que vende el marker entrega también con éste un papel mostrando como va a correr y las bandas que indican tamaños según los pares de bases. Así podemos saber cuantos pares de bases tienen las PCR y el plásmido.

Cuarta semana (05/06/08)

Extrajimos los plásmidos de las bacterias E. Coli de nuestro medio LB, siguiendo detalladamente los pasos del protocolo adecuado:

Tomamos una alícuota de 5 ml de nuestro cultivo de bacterias E.Coli y lo centrifugamos, quedándonos con el pellet (el sobrenadante esta compuesto por los componentes del medio y en el pellet estan las bacterias)
Agregamos un Buffer que tiene EDTA (por su acción quelante ayuda a desestabilizar más adelante a la membrana bacteriana) también tiene un colorante azul, Lyse Blue, (que me indica cuando todo esta homogeneizado).
Agregamos otra solución Buffer (compuesta por NaOH y SDS). Se produce una lisis básica, y el colorante de transparente cambia a azul. Hay que mezclar por inmersión, ya que todo lo que tengo dentro del tubo es demasiado sensible, hasta que el color azul sea igual en todos lados.
Agregamos el tercer Buffer que baja el pH favoreciendo la renaturalización del ADN. pero como es un cambio brusco se renaturaliza mal y lo que obtengo es todo un precipitado de restos de membranas,paredes ADN genómico etc., el colorante pasa de azul a incoloro (se mezcla por inmersión nuevamente).
Como el plásmido es muy chiquito y además esta unido fisicamente, no se separa y se puede renaturalizar bien. Me queda en solución.
centrifugamos.
Colocamos la solución en una columnita donde va a quedar unido en la recina el ADN, pasando a través de ella (enzimas, etc). Centrifugar.
Lavamos con un Buffer que separa proteínas y sales del plásmido. Centrifugar.
Se le agrega otro Buffer con el fin de seguir lavando y purificando nuestro plásmido. Centrifugamos. Colocamos otro Buffer que va a despegar el plásmido de la columnita (centrifugando para asegurarnos que bajo todo el plásmido purificado).

Preparamos un Gel de agarosa 1% p/v en 45 ml
Colocamos en los pocillos del gel las tres PCR y la solución del plásmido (cada una con 1,25 μl de Buffer loading (que por su densidad, contiene glicerina, nos ayuda a sembrar haciendo lo que sembramos baje al posillo y no se quede flotando, y el colorante que tiene nos permite visualizar el frente de corrido).

La semana que viene vamos a ver los resultados de otro gel de agarosa.

Tercer semana (29/05/08)

Amplificamos una secuencia de ADN de 800pb del promotor de UGA-3. Para esto usamos la técnica de PCR, los componentes para llevar a cabo esta son:
Buffer
dntp
MgCl2
Primer
DNA pol (Taq polimerasa, termoestable, sobrevive a las altas temperaturas)
Molde de DNA genómico
H2O
Calculamos sus concentraciones necesarias para que todo este en 150 μl

*A la hora de mezclar todo es importante tener en cuenta que lo primero que se debe poner es el agua y el Buffer porque los demás componentes son muy sensibles como para colocarlos en el tubo vació sin que nada les pase.

Preparamos tres tubos de PCR con 50 μl cada uno de mezcla. Dos de ellos con el molde (los llamaremos positivos (+)) y uno sin él (a este lo llamaremos negativo (-)). Es necesario hacer el tubo negativo porque nos indica si hubo contaminación o no y si lo que tengo en los tubos es sólo el ADN gel gen UGA-3 o también otras cosas. Nos queremos asegurar de estar amplificando sólo la secuencia seleccionada.

Para hacer la PCR se hace un programa dónde se calienta todo a 94°C (para separar las cadenas de ADN) se baja la temperatura a 63°C (a esta temperatura se unen los primers) y luego se sube a 72°C (que es la temperatura óptima para la polimerización). Este programa se hace en ciclos para amplificarlo y tener mucho producto.

Programa utilizado:
94°C 5min
94°C 1min\
63°C 1min ) se repite 30 veces.
72°C 2min/
72°C 5min