Decimoséptima semana (16/10/08)

Hicimos una reacción de ligación.
Preparamos dos tubos, uno con H2O, Buffer, vector, inserto y la ligasa, y el otro igual pero sin el inserto, esto va a servir para poder verificar que las dos puntas del vector no se hayan unido de vuelta. Lo dejamos en un baño de agua a 26ºC durante una hora para que se ligue correctamente el inserto con el vector. Luego procedimos con el siguiente protocolo:
Transformación de E. coli
1. Poner 100 ml de células competentes y 20 ml de rx de ligación en un eppendorff estéril. Hacer control con 100 ml de células competentes y 0.5 ml de plásmido control (purificado x kit QUIAGEN)
2. Incubar 30 minutos en hielo
3. Incubar 2 minutos a 42 ˚C
4. Incubar 5 minutos en hielo
5. Agregar 1 ml (o 450 ml) de medio LB sin Ampicilina
6. Incubar 1 hora a 37 ˚C a 225 rpm
7. Centrifugar las células y resuspender el pellet en el sobrenadante restante
8. Sembrar todo el contenido de cada tubo en placas con medio LB + AmpicilinaColocar en estufa a 37 ˚C

Decimosexta semana (02/10/08)

Hicimos PCR para amplificar el inserto (800 pb del promotor de UGA3), y cortamos con enzimas de restruccion (EcoRI y BamI). Al tubo del vector le agregamos la fosfatasa y dejamos en la estufa a 37ºC durante hora y media para que se desfosfate bien. Luego purificamos con tres soluciones buffer el vector y el inserto.
Preparamos un gel de agarosa donde pusimos los insertos y dejamos correr.

Decimoquinta semana (25/09/08)

Hicimos de nuevo las transformaciones de hace dos semanas, ya que algunas presentaban hongos y demás contaminaciones.
Procedimos de igual manera;
crecimos las cepas en placas de medio rico,limpiamos, centrifugamos, usamos una solución que nos ayuda a que el plásmido entre en la célula, incubamos y plaqueamos.

Decimocuarta semana (18/09/08)

Observamos los resultados de la anterior semana.
Usamos el plásmido que purificamos en una de las semanas y lo cortamos con una enzima de restricción (HindIII). Lo hicimos por duplicado.
Esto se llama hacer una digestión de un plásmido. Se usa un buffer específico, las enzimas, el plásmido y se rellena con agua. Luego se coloca a 37°C durante el periodo de una hora y media.
En un gel de agarosa 8% m/v corrimos el plásmido sin digerir en diferentes concentraciones y los dos plásmidos digeridos también en diferentes concentraciones.

La imagen muestra en los dos primeros pocillos los plásmidos sin digerir (las dos bandas que se observan pertenecen a las dos formas en las que esta CCC (que predomina) y la OC (una de las cadenas se rompió dejando al plásmido en un estado relajado). Los siguientes pocillos muestran al plásmido una vez digerido en diferentes concentraciones, donde se ve una banda que pertenece al estado del plásmido lineal (las dos cadenas cortadas). Al final está el marker y lo usamos para medir la cantidad de pares de bases y así asegurarnos de que todo corrió correctamente.